FKKT

Povzetek projekta in cilji

Cilj predlaganega projekta je raziskava možnosti uporabe bakteriofagov pri zdravljenju okužb umetnih sklepov. Število vsaditev umetnih sklepov narašča iz leta v leto, saj le-ti pomembno prispevajo k boljši gibljivosti in zmanjšanju bolečin v sklepih. Pri nekaj manj kot 10% pride do zapletov, pri čemer največji delež predstavlja aseptično omajanje sklepne proteze, redkejši a bistveno nevarnejši zaplet pa predstavljajo okužbe umetnih sklepov, saj privedejo do bolečin, nepomičnosti, omajanja proteze, zdravljenja z antibiotiki, podaljšanja ali ponovnega bolnišničnega zdravljenja, kirurškega zdravljenja, v najhujših primerih pa celo do izgube uda ali smrti bolnika. Med njimi so za zdravljenje najzahtevnejše kronične okužbe. Zahtevnost zdravljenja je pogosto povezna z nezmožnostjo diagnosticiranja okužbe zaradi nizke koncentracije bakterijskih celic oziroma njihovega fiziološkega stanja z nizko metabolno aktivnostjo. Razlog za tovrstne okužbe je pogosto v tem, da rastejo bakterije v biofilmih, lahko pa gre tudi za intracelularne okužbe (npr. osteoblastov), zaradi česar je učinkovitost delovanja antibiotikov bistveno zmanjšana.
Projekt se bo osredotočil na možnost uničevanja bakterijskih celic S. aureus in S. epidermidis, ki sta najpogostejši  razlog okužb umetnih sklepov. Uporabili bomo bakterijske seve iz mikrobioloških bank pa tudi lastne klinične izolate, enako velja za bakteriofage. Izbrali bomo tiste bakteriofage, ki pod pogoji eksponentne rasti dobro lizirajo izbrane bakterijske seve. Značilno za biofilme je, poleg ekstracelularnih polisaharidov, ki povezuje bakterijske celice, tudi raznolikost fizioloških stanj bakterij znotraj biofilma. Zato bomo z uporabo kontinuirnega gojenja bakterij pri različnih fizioloških stanjih določevali fagne parametre, kot so brstno število, latentna perioda ter konstanta adsorpcije, ter tako posredno določali učinkovitost morebitne bakteriofagne terapije. Prav tako bomo preverili delovanje bakteriofagov na samih biofilmih, ki jih bomo tvorili pod različnimi pogoji in primerjali rezultate eksperimentov. Preverili bomo tudi učinkovanje bakteriofagov na bakterije, ki so v t.i. živem, vendar nekultivabilnem (VBNC, iz angl. viable but non culturable) fiziološkem stanju celic.

Velik sklop eksperimentov bo namenjen delovanju bakteriofagov na intracelularne okužbe primarnih humanih celic, ki sodelujejo pri osteointegraciji sklepne proteze, osteoblastov, s prej navedenimi sevi. Pri tem bomo preverili, katere vrste bakteriofagov so sposobne vstopati v te primarne humane celice, kako fiziološko stanje bakterije vpliva na intracelularno okužbo teh celic in končno, ali in kako so bakteriofagi sposobni uničevanja intracelularnih bakterij. 

Projekt ima sledeče cilje:

• Določiti vpliv fiziološkega stanja (vključno z VBNC) prostorastočih bakterijskih sevov vrst S. aureus in S. epidermidis na učinkovanje litičnih bakteriofagov.
• Določiti učinkovitost bakteriofagov pri uničevanju biofilmov tvorjenih z zgoraj navedenimi bakterijskimi sevi.
• Določiti bakteriofage, ki so sposobni prehajati v primarne humane celice.
• Določiti vpliv fiziološkega stanja bakterij na sposobnost njihovega prodiranja (intracelularno okužbo) v primarne humane celice.
• Določiti učinkovitost bakteriofagov pri zdravljenju intracelularnih okužb primarnih humanih celic.
• Na osnovi pridobljenih rezultatov predlagati algoritem zdravljenja okužb umetnih sklepov s pomočjo bakteriofagov, kar bo izhodišče za kasnejšo pripravo kliničnega preizkušanja.

Faze

1. Izolacija kliničnih sevov bakterij in določanje ustreznih litičnih bakteriofagov
2. Namnoževanje bakterijskih sevov v šaržnih pogojih in določitev rastnih pogojev ter parametrov
3. Namnoževanje bakterijskih sevov v kontinuirnem bioprocesu
4. Vzpostavitev vzporednega kontinuirnega bioprocesa različnih sistemov bakterija-bakteriofag, določitev bakteriofagnih parametrov ter na osnovi tega oceniti potencialno učinkovitost bakteriofagne terapije
5. Priprava biofilmov ter VBNC stanja bakterij in testiranje delovanja bakteriofagov nanje
6. Izolacija, gojenje in karakterizacija primarnih humanih celic
7. Razvoj metod spremljanje prodiranja bakteriofagov v sesalske celice
8. Testiranje vstopanja bakteriofagov v sesalske celice
9. Inficiranje celičnih linij s konkretnimi bakterijskimi sevi in preučitev vpliva fiziološkega stanja bakterije na infekcijo
10. Testiranje učinkovitosti bakteriofagov na intracelularne bakterijske okužbe
11. Implementacija bakteriofagov na infekcije implantatov

Rezultati

Rezultati projekta bodo sproti objavljeni in posodobljeni.