FKKT

Aplikativni raziskovalni projekt je umeščen na področji genskega inženirstva in sintezne biologije. V okviru tega projekta sodelujemo raziskovalci s štirih ustanov: Univerze v Ljubljani – Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo, Instituta »Jožef Stefan«, Nacionalnega inštituta za biologijo in biotehnološkega podjetja Jafral, ki sodeluje tudi kot sofinancer raziskav.

Osnovni cilj projekta je vzpostavitev postopka za sestavljanje segmentov DNA v daljša funkcionalna zaporedja. Vzpostavitev takšne platforme ima lahko veliko aplikacij, v tem projektu pa bomo prikazali uporabnost na področju razvoja proizvodnje bioloških zdravil in celične terapije.

V postopku proizvodnje bioloških zdravil je potrebno upoštevati vlogo številnih genetskih dejavnikov in pripraviti seve, ki imajo optimalne lastnosti s stališča ravni izražanja genov in stabilnosti. Za optimalno proizvodnjo niso dovolj posamezne genetske lastnosti, pač pa njihove kombinacije, kar je mogoče ugotoviti z visokozmogljivimi tehnikami funkcijske genomike, proteomike in metabolomike. Ustrezne kombinacije genetskih lastnosti pa je treba najprej sestaviti in nato natančno preučiti, preden dobimo optimiziran sev za proizvodnjo.

Tudi pri napredni celični terapiji na osnovi bolniku lastnih limfocitov T je potrebno preizkusiti veliko različnih kombinacij imunskih receptorjev, ki jih je treba predhodno pripraviti na ravni DNA. Poleg tega bo uvedba zapisov za izbrane dodatne proteine predvidoma povečala učinkovitost tako pripravljenih limfocitov.

Projekt je imel tri osnovne cilje, ki sovpadajo s fazami oziroma delovnimi svežnji. 

Cilj 1: Razvoj platforme za hierarhično sestavljanje genov 

Pripravili smo knjižnico genetskih elementov, za katere smo predvidevali, da bodo uporabni za načrtovane aplikacije v celicah kvasovke Saccharomyces cerevisiae: dva promotorja, transkripcijski terminator, gena za poročevalska proteina zeleni fluorescenčni protein (eGFP) in β-galaktozidazo (LacZ), zaporedje za signalni peptid za α-faktor kvasovke S. cerevisiae, selekcijski označevalec KanMX4 ter minimalno zaporedje telomer (TeSS; ang. telomere seed sequence). Vse naštete elemente smo z metodo sestavljanja po Gibsonu vstavili v plazmide, iz katerih smo jih kasneje v različnih kombinacijah vstavljali v umetni kromosom kvasovke (YAC). Knjižnico fragmentov, iz katerih smo sestavljali genome rekombinantnih bakteriofagov, smo pomnoževali z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) iz genomov naravnih bakteriofagov. Zaporedje za nanotelo proti proteinu bodice virusa SARS-CoV-2 smo pridobili v obliki sintetične DNA. Na osnovi vektorja pYAC4 smo sestavili različice umetnega kromosoma pYAC4_TeSS, ki smo ga uporabili za sestavljanje genomov rekombinantnih bakteriofagov. Posamezne genetske elemente in vmesna zaporedja DNA smo pomnožili s PCR, vnesli v celice kvasovke, kjer so se sestavili v procesu popravljanja zaporedij DNA s homologno rekombinacijo. Vrstni red fragmentov v sestavljeni molekuli smo določili z ustreznimi prekrivajočimi se zaporedji DNA, ki smo jih dodali ob pomnoževanju s PCR. Ustreznost sestavljenih zaporedij DNA smo preverili s pomnoževanjem stikov s PCR oziroma s sekvenciranjem sestavljenih vektorjev. Pripravili smo tudi začetno knjižnico elementov za sestavljanje policistronskega operona po metodi GoldenGate (GG) za sočasno izražanje imunskih receptorjev, markerjev in dodatnih molekul z enega plazmida. Knjižnica vsebuje štiri elemente za T-celični receptor (TCR) in markerje izražanja. Nato smo pripravili set kompleksnih genskih konstruktov za razvoj celičnih terapij, vključno z retrovirusnimi in lentivirusnimi prenašalnimi plazmidi, kjer funkcionalne elemente, kot so reporterski geni, izrazimo konstitutivno z ene molekule mRNA. To smo dosegli s postavitvijo zaporedja, ki kodira element p2A, med dva reporterska gena. Poleg metode GG smo uporabili tudi klasično molekulsko kloniranje z restrikcijskimi encimi. Pripravili smo retrovirusne in lentivirusne prenašalne plazmide za genske in celične imunoterapije, vključno s tremi variacijami retrovirusnega prenašalnega plazmida in eno arhitekturo lentivirusnega prenašalnega plazmida. Najkompleksnejši konstrukti združujejo 6 funkcijskih elementov, ki omogočajo modularno kloniranje. Ti elementi tvorijo dva modula: prvi omogoča konstitutivno izražanje dveh reporterskih proteinov, drugi pa od celic T odvisno izražanje reporterskega plazmida z uporabo DNA-vezavnega mesta za transkripcijski faktor NFAT in minimalni promotor. Ovrednotili smo modularni način kloniranja z zamenjavo reporterskega gena z himernim antigenskim receptorjem (CAR). 

Cilj 2: Testiranje modelnih DNA-konstruktov v sistemih sesalcev in v kvasovkah 

Eden izmed ciljev projekta je bil s homologno rekombinacijo v celicah kvasovke sestaviti genom rekombinantnega bakteriofaga T7 z vstavljenim zapisom za zeleni fluorescenčni protein na dveh vnaprej določenih mestih v genomu. V nadaljevanju smo genom prenesli v celico E. coli, kjer so se bakteriofagi razmnoževali. Rekombinantni genom v vektorju pYAC4_TeSS smo uspešno sestavili s homologno rekombinacijo devetih fragmentov DNA (velikosti ~5 kbp), ki so ustrezali genomu bakteriofaga T7, enega fragmenta, ki je nosil zapis za GFP (velikosti 800 bp) in dveh fragmentov, ki sta vsebovala potrebne elemente vektorja (velikosti ~5 kbp). Nadalje smo želeli pripraviti rekombinantni genom bakteriofaga z vnaprej izbranim gostiteljskim območjem. V ta namen smo genom rekombinantnega bakteriofaga T7 v vektorju pYAC4_TeSS v celicah kvasovke spremenili z uporabo metode CRISPR-Cas9 tako, da smo odsek v rekombinantnem genomu bakteriofaga T7, ki kodira C-končni del proteina gp17, ki določa gostiteljsko območje, nadomestili z ustreznim zaporedjem iz genoma bakteriofaga T3, s čimer smo pridobili rekombinantni bakteriofag T7T3(C-gp17). Konstrukte za celično zdravljenje smo sprva testirali na ravni prehodnega vnosa z nukleofekcijo v človeško linijo celic T. S pretočno citometrijo smo uspešno dokazali konstitutivno izražanje reporterskega gena z lentivirusnega prenašalnega plazmida. Za testiranje delovanja smo uporabili metodo spektralne pretočne citometrije. Metodo smo prilagodili tako, da smo poleg zaznavanja poročevalskih genov hkrati zaznavali tudi druge lastnosti celic, kot so živost ter izražanje značilnih površinskih proteinov. 

Cilj 3: Biomedicinske aplikacije 

V projektu smo vzpostavili sistem za proizvodnjo nanotelesa proti proteinu bodice virusa SARS-CoV-2 kot modelnega nanotelesa v kvasovki S. cerevisiae. Dodatno smo za lažjo izvedbo izolacije želeli, da bi produkcijski sev izločal nanotelo v gojišče, zato smo kodirajočemu zaporedju za nanotelo dodali zapis za signalni peptid α-faktorja kvasovke. Takšen konstrukt smo z metodo sestavljanja po Gibsonu vstavili v ekspresijski plazmid za kvasovke pod kontrolo inducibilnega promotorja, ga namnožili v bakteriji E. coli in vnesli v kvasovko. Na C-konec hibridnega proteina α-faktor-nanotelo smo dodali še heksahistidinsko oznako za lažjo detekcijo. Ugotovili smo, da je 24 ur po indukciji transkripcije gena za nanotelo količina rekombinantnih nanoteles dovolj velika (tako v celicah kot v gojišču), da jih lahko zaznamo z imunodetekcijo. Vzporedno smo testirali fitnes celic kvasovke, ki so vsebovale vektor pYAC4_TeSS z različno velikimi vključki in ugotovili, da se fitnes ne spremeni zaznavno v primerjavi s celicami, ki tega vključka nimajo. S tem smo dokazali, da v projektu razviti vključki nimajo negativnih učinkov na gostiteljske celice kvasovke S. cerevisiae [1]. Bakteriofagom s prilagoditvami za vnaprej izbrano gostiteljsko območje smo določili gostiteljsko območje z okužbo specifičnih sevov E. coli. Po zamenjavi C-končnega zaporedja proteina gp17 bakteriofaga T7 s tistim iz T3 smo okužili 7 različnih sevov E. coli s fagi T7, T3 in hibridnimi T7T3(C-gp17). Ugotovili smo, da ima hibridni fag popolnoma enak razpon gostiteljev kot T3, medtem ko je gostiteljsko območje bakteriofagov T3 in T7 ustrezalo navedbam v literaturi. S tem smo potrdili, da lahko z urejanjem rekombinantnega genoma bakteriofagov v celicah kvasovke natančno določimo njihovo gostiteljsko območje. Genske konstrukte za celično zdravljenje smo testirali tako na ravni prehodnega kot stabilnega izražanja. Na osnovi retrovirusnega prenašalnega plazmida smo pripravili retrovirusne delce in s pretočno citometrijo dokazali konstitutivno izražanje reporterskega gena v mišji celični liniji in primarnih mišjih celicah T. Ker smo z modularnim kloniranjem pripravili različne retrovirusne prenašalne plazmide, smo lahko ovrednotili vpliv in doprinos različnih elementov ter s tem ugotovili, katere arhitekture izkazujejo boljše funkcionalnosti za nadaljnji razvoj celičnih imunoterapij. Lentivirusni prenašalni plazmid smo vnesli v človeško celično linijo celic T in dokazali konstitutivno izražane reporterskega plazmida. V prijavi projekta smo originalno načrtovali znižanje izražanja T-celičnega receptorja (TCR) z uporabo shRNA. Zaradi spodbudnih preliminarnih rezultatov in strateške usmeritve raziskovalnega dela smo se odločili preusmeriti na tehnologijo CRISPR/Cas9. Vzpostavili in optimizirali smo to metodo za urejanje genoma v različnih populacijah celic T z nukleofekcijo ribonukleoproteinskih (RNP) kompleksov. Ciljali smo lokus TRAC v človeški liniji celic T in nato v različnih populacijah primarnih mišjih celic T. Analiza s pretočno citometrijo je pokazala visoko učinkovitost izbitja (do 95 %) in ustrezno živost.

1. L. Guiollot, Design and functional validation of an upgraded single-vector genetic platform for cellular immunotherapy. 2024 [COBISS.SI-ID 215067907]

2. U. Hancman et al., Design and characterization of a yeast artificial chromosome for bacteriophage genome assembly and editing in yeast cells. 2025 [COBISS.SI-ID - 229391875]

3. K. Leben Zupet et al., Finding regulatory T cells. 2024 [COBISS.SI-ID 196393987]

4. K. Manzoni et al., Unlocking regulatory T cell potential : from ex vivo expansion to single cell profiling. 2024 [COBISS.SI-ID 210805507]

5. J. Pohar, Why and how: regulatory T cells for immunotherapy of autoimmune diseases. 2024 [COBISS.SI-ID 201560067]

6. T. Ratajc et al., Hierarchical DNA assembly in yeast cells. 2023. [COBISS.SI-ID 165893891]

7. T. Ratajc, Priprava in manipulacija umetnega kromosoma kvasovke, 2024 [COBISS.SI-ID 219310339]

8. A. Šarac et al., Validation of CRISPR/Cas9-mediated T cell receptor knockout in the Jurkat line. 2023 [COBISS.SI-ID 154994435]

9. A. Šarac et al., CRISPR-mediated TCR knock-out in Jurkat and primary mouse T cells to improve CAR-T cell therapy. 2024 [COBISS.SI-ID 211405571]

10. A. Šarac et al., Improving CAR-T cell immunotherapy with CRISPR/Cas9 gene editing. 2024 [COBISS.SI-ID 207210755]

11. Šarac et al., CAR-T immunotherapy for cancer : Opportunities for improvement of manufacturing and functionality. 2024 [COBISS.SI-ID 196390403]

12. Ž. Žnidar et al., Creating a model system for production of nanobodies in yeast Saccharomyces cerevisiae. 2023 [COBISS.SI-ID 165585923]

13. Ž. Žnidar, Vzpostavitev modelnega sistema za proizvodnjo nanoteles v kvasovki Saccharomyces cerevisiae. 2023 [COBISS.SI-ID 165400835]

14. G. Žun et al., Construction and Evaluation of gRNA Arrays for Multiplex CRISPR-Cas9. 2023 [COBISS.SI-ID 134845187]