FKKT

Uvod

Aplikativni raziskovalni projekt je umeščen na področji genskega inženirstva in sintezne biologije. V okviru tega projekta sodelujemo raziskovalci s štirih ustanov: Univerze v Ljubljani – Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo, Instituta »Jožef Stefan«, Nacionalnega inštituta za biologijo in biotehnološkega podjetja Jafral, ki sodeluje tudi kot sofinancer raziskav.

Osnovni cilj projekta je vzpostavitev postopka za sestavljanje segmentov DNA v daljša funkcionalna zaporedja. Vzpostavitev takšne platforme ima lahko veliko aplikacij, v tem projektu pa bomo prikazali uporabnost na področju razvoja proizvodnje bioloških zdravil in celične terapije.

Izhodišča za raziskavo

V postopku proizvodnje bioloških zdravil je potrebno upoštevati vlogo številnih genetskih dejavnikov in pripraviti seve, ki imajo optimalne lastnosti s stališča ravni izražanja genov in stabilnosti. Za optimalno proizvodnjo niso dovolj posamezne genetske lastnosti, pač pa njihove kombinacije, kar je mogoče ugotoviti z visokozmogljivimi tehnikami funkcijske genomike, proteomike in metabolomike. Ustrezne kombinacije genetskih lastnosti pa je treba najprej sestaviti in nato natančno preučiti, preden dobimo optimiziran sev za proizvodnjo.

Tudi pri napredni celični terapiji na osnovi bolniku lastnih limfocitov T je potrebno preizkusiti veliko različnih kombinacij imunskih receptorjev, ki jih je treba predhodno pripraviti na ravni DNA. Poleg tega bo uvedba zapisov za izbrane dodatne proteine predvidoma povečala učinkovitost tako pripravljenih limfocitov.

Znanstveno-tehnološki problem in predlagane rešitve

Za genski inženiring proizvodnih celičnih linij še vedno pretežno uporabljamo klasične metode molekulskega kloniranja, ki temeljijo na uporabi restrikcijskih endonukleaz in ligaze. Gene običajno vstavljamo v vektorje (npr. plazmide) po postopku, ki omogoča hkratno vstavitev enega samega konstrukta. Tudi za pripravo celic za celično zdravljenje, kjer kot končne vektorje lahko uporabljamo viruse, je postopek podoben.

Ker je treba pripraviti zelo veliko (tudi več sto ali tisoč) vektorskih konstruktov, preden lahko izberemo optimalnega, so trenutno uporabni načini sestavljanja DNA prepočasni in premalo učinkoviti.

Zato smo se odločili, da pripravimo rešitve in jih preizkusimo s konkretnimi konstrukti na ravni DNA in celic. Cilji projekta so:

1. Ustvariti knjižnico genetskih elementov (sintetični biološki deli, npr. promotorji, signali za poliadenilacijo in kodirajoča zaporedja) za optimizacijo celičnih linij v biotehnološki proizvodnji učinkovin in celični terapiji.

2. Razviti učinkovito platformo za hierarhično sestavljanje DNA za napredne aplikacije pri proizvodnji bioloških zdravil in v celičnih terapiji.

3. Razviti prehodne ekspresijske vektorje za učinkovito uvajanje velikih kompleksnih molekul DNA v ciljne celične linije.

4. Preizkusiti tako razviti sistem za spreminjanje proizvodnega seva oziroma T-celične linije.

Predvideni potek dela

Delo smo razdelili v tri sklope, ki jih prikazuje spodnji grafikon.

V prvem delu želimo torej poiskati način za čim bolj učinkovito sestavljanje odsekov DNA v funkcionalne enote. To bomo izvedli s pripravo knjižnice operonov, ki bodo vsebovali promotorje za sesalske celice oziroma celice kvasovk in poliadenilacijske signale, s standardiziranimi restrikcijskimi mesti za uporabljen sistem sestavljanja, čemur bodo prilagojeni tudi sintetizirani konstrukti. Pripravili bomo tudi policistronske konstrukte, pri katerih bodo posamezne enote povezane z zapisi za samocepitvene 2A-peptide. Dobljene konstrukte bomo uporabili v optimiziranem sistemu za prehodno izražanje genov, ki ga bomo šele razvili, temeljil pa bo na že opisanih sistemih. To fazo projekta želimo zaključiti s pripravo vektorjev za vnos več operonov, kar bomo pripravili in vitro, v nekaterih primerih pa v kvasovkah.

Tako bomo torej pripravili na ravni DNA eno- in večoperonske konstrukte, ki jih bomo v osrednjem delu projekta preizkusili najprej z uporabo poročevalskih genov v enooperonskih konstruktih in nato v večoperonskih konstruktih. Testirali bomo tudi episomski vektorski sistem za prehodno izražanje, prav tako z uporabo poročevalskih genskih konstruktov.

Ker gre za aplikativni projekt, je ključna izvedba zadnjega sklopa raziskav, ki bo vključeval sočasno izražanje večoperonskih konstruktov za proizvodnjo biofarmacevtsko pomembnih proteinov in za pripravo celic za celično terapijo.

Prvi sklop raziskav bomo predvidoma končali v letu in pol. Po prvem letu bomo zato predvidoma že lahko začeli z delom na drugem sklopu in s približno polletnim zamikom še z aplikativnim delom raziskav.

Vodenje projekta in obveščanje o rezultatih

Sodelavci z vseh štirih ustanov se bomo srečevali mesečno, vsake pol leta pa bo sestanek v obliki minikonference, kjer bomo tudi analizirali skladnost izvedbe s terminskim načrtom in, če bo potrebno, prilagodili potek nadaljnjih raziskav. Pregledali bomo tudi finančne vidike izvedbe projekta. 

Projekt bo finančno podprlo podjetje Jafral, ki bo tudi sodelovalo pri izvedbi projekta in bo izsledke lahko uporabilo pri lastnih raziskavah in razvoju.

Znanstvene objave bodo izšle v revijah s prostim dostopom. Letna poročila bomo pripravili za agencijo za raziskovalno dejavnost in za sofinancerja, povzetki pa bodo na voljo tudi na spletni strani.