FKKT

Uvod

Dramatične spremembe v biologiji in biotehnologiji so narekovale potrebo po razvoju novih orodij za gojenje mikrobnih, rastlinskih ali živalskih celic bodisi za in vitro analitiko, za razvoj novih bioloških produktov ali za razvoj in optimizacijo bioprocesov.  V zadnjem desetletju je napredek v mikroizdelovalnih tehnologijah doprinesel k razvoju mikrofluidnih (MF) sistemov, ki omogočajo zagotavljanje nadziranega, fiziološko bolj relevantnega okolja za gojenje celic. MF sistemi so idealni tudi za izvedbo visokozmogljivostnih presejalnih testov in analiz z uporabo zelo majhnih količin snovi. Poleg tega njihova integracija z biosenzorji priteguje vedno večjo pozornost, tako za medicinsko diagnostiko kot za bioanalizo.

Biofilmi so opredeljeni kot večcelične bakterijske skupnosti, vgrajene v samoproizveden in na površino pritrjen polimerni matriks, ki jim omogoča zaščito pred neugodnimi razmerami. Razvoj biofilmov je visoko reguliran proces, odvisen od signaliziranja med celicami imenovanega tudi zaznavanje kvoruma (QS), ki nadzira sintezo matriksa in številne biotehnološko pomembne procese. Za proučevanje biofilmov se večinoma uporabljajo mikrotitrske plošče, ki pa ne omogočajo študije procesov na ravni posameznih celic in ne zagotavljajo nadziranih pogojev gojenja. Vitamin B2 (riboflavin) je primarni metabolit, ki ga gensko spremenjeni sevi Bacillus subtilis proizvajajo v industrijskih količinah (> 2000 ton letno). Ta vitamin potrebujejo vse celice za biosintezo različnih flavoproteinov, ki katalizirajo številne izredno pomembne reakcije oksidacije in redukcije.

Cilji

Projekt vključuje 3 ključne cilje:

a) razviti produktivne biofilme v mikropretočni napravi za poglobljene študije rasti in fiziologije biofilmov Bacillus sp. v nadzorovanih razmerah. Gre za eno prvih študij, kjer bomo uporabili pretočne MF naprave za izboljšanje razumevanja časovnega razvoja biofilma in biosinteze primarnega metabolita v izbranem modelnem organizmu. Modeliranje izgradnje biofilma in sinteze metabolita bo omogočilo tudi vpogled v procese, ki so fiziološko, medicinsko in industrijsko izredno pomembni.

b) razviti ultra-visokozmogljivostno MF napravo za gojenje sevov B. subtilis v kapljičnih mikrobioreaktorjih z namenom detekcije sposobnosti produkcije industrijsko in komercialno pomembega vitamina riboflavina. V Acies Bio so z genetskim inženiringom že razvili nekaj visokoproduktivnih sevov B. subtilis. Za nadaljnje izboljšanje produktivnosti bomo uporabili mutagenezo, ki vodi v zelo veliko število mutant. Da bi izolirali nov sev z izboljšanimi produkcijskimi lastnostmi, je  potrebna zelo visoka pretočnost presejanja, ki jo bomo dosegli z MF platformo za pripravo ter sortiranje kapljičnih mikrobioreaktorjev, v katerih je omogočeno gojenje posameznih celic. Uporaba kapljičnih mikrobioreaktorjev bo omogočila tudi hitro proučevanje učinkov sprememb v sestavi gojišča in koncentraciji kisika, ki običajno onemogoča korelacijo med bioprocesi na laboratorijskem in industrijskem nivoju. Omenjene parametre bomo proučevali na nivoju ene celice, kar bo omogočilo globlje razumevanje fiziologije Bacillus sp.

c) razviti stabilen biosenzor s sporami B. subtilis, imobiliziranimi na površino mikrokanalov, za uporabo pri določanju antioksidantov v živilih in kasneje tudi za razgradnjo različnih fenolnih spojin, ki so onesnaževalci v odpadnih tokovih kemijske, papirne, tekstilne in farmacevtske industrije. Z razvojem prototipa MF sistema z imobiliziranimi sporami bomo nadgradili izhodiščni miniaturiziran šaržni sistem, kjer je potrebno spore odstranjevati.

Faze projekta

V okviru projekta bomo razvili mikrofluidne naprave s senzorji za gojenje celic, s katerimi bomo v rekombinantnih sevih Bacillus subtilis preučevali dinamiko rasti biofilmov in posameznih celic ter bakterijski odziv na pogoje gojenja na ravni izražanja genov. Pripravili bomo tudi ultra-visokozmogljivostni mikrofluidni sistem za presejanje in izbor B. subtilis z visoko proizvodnjo riboflavina in optimizacijo pogojev v kapljičnih mikrobioreaktorjih, kar nam bo omogočalo postavitev visoko produktivne proizvodnje riboflavina v tradicionalnih bioreaktorjih. Poleg tega bomo razvili biosensor na osnovi mikrofluidne platforme z imobiliziranimi endosporami, ki vsebujejo lakaze, s katerim bomo vrednotili antioksidativno kapaciteto živil.

Rezultati

Objavljene publikacije:

Stojkovič G., Žnidaršič-Plazl P. (2020) Covalent Immobilization of Microbial Cells on Microchannel Surfaces. In: Guisan J., Bolivar J., López-Gallego F., Rocha-Martín J. (eds) Immobilization of Enzymes and Cells. Methods in Molecular Biology, vol 2100. Humana, New York, NY