FKKT

Povzetek projekta in cilji

Epitelijska celična adhezijska molekula (EpCAM) je pomembna molekula v regulaciji celične adhezije in signaliziranja v epitelijskih celicah. Njegova glavna signalna pot se začne z regulirano intramembransko proteolizo (RIP). Pri RIP se sprosti znotrajcelična domena EpCAM (EpIC), ki interagira z osrednjima komponentama signalne poti Wnt, proteinoma ß- katenin in Lef1. EpIC se najprej poveže s proteinoma FHL2 in ß-katenin, s katerima se nato prenese v jedro, kjer skupaj interagirajo še s proteinom Lef1. Nastali signalni kompleks EpIC-FHL2-ß-katenin-Lef1 sproži prepisovanje onkogenov: ciklinov A, D1 in E ter gena c-myc. Na ta način EpCAM spodbuja proliferacijo rakastih celic, zaradi česar je to eden od glavnih razlogov za slabo prognozo pri povišanem izražanju EpCAM v karcinomih.

Kakšna je vloga EpIC v tem signalnem kompleksu še ni znano. Čeprav je RIP že dodobra preučen so se raziskovalci večinoma osredotočili na iskanje aktivatorjev RIP in na analizo poteka proteolitičnih cepitev. Vloga EpIC je še toliko bolj nejasna, ker so ostali trije interakcijski partnerji sami sposobni vplivati na prepisovanje istih genov tudi brez prisotnost EpIC. Poleg tega nimamo nobenih strukturnih podatkov o kompleksu EpIC-FHL2-ß-katenin- Lef1, skopi pa so tudi strukturni podatki o ß-katenin/Lef1 signalnih kompleksih na splošno.

V sklopu projekta bomo izrazili in očistili celoten signalni kompleks EpIC-FHL2-ß-katenin-Lef1. Z integrativnim modeliranjem bomo na osnovi različnih strukturnih podatkov, pridobljenih s krioelektronsko mikroskopijo (Cryo-EM), analizo ozkokotnega sipanja retgenskih žarkov (SAXS) in prečnim povezovanjem sklopljenim z masno spektrometrijo (XL-MS) določili strukturo kompleka z visoko resolucijo z vezanim EpIC in brez njega ter vezanega in nevezanega na tarčno zaporedje DNA. Na koncu bomo relevantnost teh struktur potrdili še s študijami na celičnih kulturah.

S tem bomo ne samo pojasnili vlogo EpIC v signaliziranju EpCAM, temveč tudi pridobili tudi do sedaj najbolj popolne strukturne podatke visoke resolucije o katerem koli ß-katenin/Lef1 signalnem kompleksu. Ti podatki bodo v prihodnosti omogočili načrtovanje nove generacije zdravilnih učinkovin za zdravljenje karcinomov.

Slika 1: Regulirana Intramembranska Proteoliza EpCAM. Ključni korak v RIP in nastanku signalnega kompleksaEpIC-FHL2-ß-katenin-Lef.EpCAM je predstavljen z orisom oblike. Strukturi katalitične domine TACE, γ-sekretase sta prikazani s trakovi (PDB: 1bkc and 5a63). Preostanek TACE, FHL2, Lef1 in ß-katenin so prikazani shematsko, velikosti prikazov pa ustrezajo njihovi masi.

Slika 2: Shematski prikaz interakcij v signalnem kompleksu EpIC-FHL2-ß-katenin-Lef1. Model EpIC je bil narejen z MODELLER. Orisi domen FHL2 so narejeni na osnovi strukurnih podatkov, pridobljenih z NMR (2MIU, 1X4K, 2D8Z, 1X4L). Ponovitve ARM v ß-kateninu so prikazane z vezano ß-katenin-vezavno domeno proteina Lef1(3OUW), označen je tudi relativni položaj N- in C-končnih domen (NTD in CTD), katerih struktura ni znana. Večina proteina Lef1 z izjemo DNK vezavne domene (2LEF) je prikazna shematsko.

Faze

Izražanje in čiščenje proteinskega kompleksa

• Načrtovanje rekombinantnih bakulovirusov
• Izražanje in čiščenje

Strukturna in funkcijska karakterizacija signalnega kompleksa EpIC-FHL2-ß-katenin-Lef1

• Določitev strukture z visoko resolucijo

Funkcijska karakterizacija signalnega kompleksa EpIC-FHL2-ß-katenin-Lef1

Rezultati

Rezultati projekta bodo sproti objavljeni in posodobljeni.