FKKT

Uvod

Večina proteinov v naravi je zgrajenih iz večih polipeptidnih verig. Take proteine v splošnem označimo z izrazom oligomerni proteini, posamezne verige pa imenujemo podenote. Encimi, proteini, ki delujejo kot katalizatorji kemijskih reakcij, so najpogosteje zgrajeni iz dveh ali štirih enakih podenot, torej tvorijo homodimere oz. homotetramere. Ena od poglavitnih prednosti oligomerne strukture je sodelovanje oz. kooperativnost med podenotami, ki omogoča boljšo regulacijo encimske aktivnosti v primerjavi z monomernimi encimi, ki so zgrajeni le iz ene polipeptidne verige. Kooperativnost temelji na alosterični komunikaciji med aktivnimi mesti, kjer poteka kataliza, ter dodatnimi regulatornimi (alosteričnimi) mesti. Ta komunikacija se znotraj encima prenaša po alosteričnih komunikacijskih poteh in ob vezavi liganda na eno izmed teh mest povzroči spremembo oblike oz. konformacije encima, kar posledično povzroči spremembo njegove aktivnosti.

Kljub prednostim, ki jih omogoča kooperativnost, pa se vsi encimi tekom evolucije niso razvili v kooperativne oligomere. Postavlja se vprašanje, ali bi tudi tisti, ki v naravi niso kooperativni, lahko imeli korist od tega mehanizma. Namen projekta COOPERATE je odgovoriti na to vprašanje za primer družine papainu podobnih cisteinskih peptidaz. Ti encimi cepijo peptidne vezi med aminokislinami v proteinih. Večinoma so monomeri, družina pa vključuje tudi tetramerno, nekooperativno dipeptidil-peptidazo I (DPPI). Pri človeku imajo pomembne fiziološke in patološke vloge, nekateri rastlinski člani družine pa so tudi med najbolj priljubljenimi peptidazami za biotehnološko in industrijsko uporabo.

Namen projekta bomo dosegli z inženiringom oligomernih kooperativnih različic teh encimov z uporabo dveh različnih pristopov:

• z uvedbo alosteričnih komunikacijskih poti v človeško DPPI, ki bodo omogočile izmenjavo informacij med aktivnimi mesti v obliki konformacijskih sprememb, in
• z inženiringom homo-oligomernih različic monomernih peptidaz, pri katerih bodo takšno izmenjavo informacij omogočale že obstoječe komunikacije poti, katere bomo med seboj združili na stikih podenot. Primarnih tarči bosta človeški katepsin K, najbolj znana papainu podobna peptidaza z vidika alosterične regulacije in papain, najpomembnejši član družine za biotehnološke namene.

Vsak pristop predstavlja enega od ciljev projekta (slika 1), katera bomo dosegli s kombinacijo računskih metod (identifikacija komunikacijskih poti, napovedovanje stičnih površin, itd.), proteinskskega inženiringa z mutagenezo ter funkcijske in strukturne karakterizacije ustvarjenih različic proteinov s poudarkom na mehanizmih kooperativnosti. Končni cilj je pridobiti vsaj eno različico DPPI in eno različico konstruiranega oligomera, ki bosta izkazovali pozitivno kooperativnost, značilno za naravne kooperativne encime. Primerjava ustvarjenih različic z divjimi tipi bo pokazala, v kolikšni meri lahko kooperativnost spremeni funkcijske lastnosti papainu podobnih peptidaz in kakšna je strukturna podlaga kooperativnosti, pri čemer bo poseben poudarek na konformacijskih spremembah.

Slika 1: Grafični povzetek ciljev projekta COOPERATE. Legenda: p – peptidazna domena, x – izključitvena domena, endo - endopeptidaza, dpp - dipeptidil-peptidaza. Rdeče puščice in zvezdice označujejo konformacijske spremembe.

Rezultati projekta COOPERATE bodo predstavljali bistven napredek znanosti na področju razumevanja povezav med oligomerno sestavo, kooperativnostjo in alosterično komunikacijo v proteinih in zagotovili smernice za inženiring kooperativnih industrijskih encimov z vrhunskimi kinetičnimi lastnostmi, ki jih bo mogoče natančno uravnavati.

Faze projekta

Rezultati

Rezultati projekta bodo sproti objavljeni in posodobljeni.