FKKT

Povzetek projekta

Proteini nastopajo  v mnogih bioloških procesih.  Za medicino in farmacijo je pomembno razumevanje njihovega združevanje v večje agregate. Ugotovljeno je bilo, da mnogi biokemični procesi v  celici potekajo v »kapljicah« proteinov (organelah), ki nastanejo pri razpadu raztopine proteina na dve tekoči fazi, eno bogato in drugo redko s proteinom. Vedeti želimo kako molekule proteina interagirajo z vodo, ioni in med seboj. Skratka, kako te interakcije vplivajo na agregacijo in na razpad raztopine na dve fazi. Tako bi lahko bolje razumeli delovanje proteinov ter pripravili bolj učinkovite formulacije bioloških zdravil.

Za študij interakcij med proteini in posledične agregacije smo predlagali pristop, osnovan na idejah fizike »mehke« snovi. Naša teorija (1-4) velja v razmerah, ko so Coulombske sile, zaradi dodanega elektrolita, oslabljene. Proteine smo ponazorili kot toge kroglice, kot ročke ali delce v obliki črke Y (monoklonska protitelesa), posute z aktivnimi mesti, med katerimi delujejo privlačne sile.  Potencial interakcije ima globino in doseg velikosti vodikove vezi. V nasprotju s centralno simetričnimi potenciali (teorija DLVO) pa pri našem modelu vezavna  mesta na površini omogočajo kotno odvisne interakcije med proteini. Takšni modeli, ovrednoteni z Wertheimovo integralsko enačbo in/ali perturbacijsko teorijo, omogočajo uspešno analizo merskih podatkov pa tudi napoved količin, ki še niso izmerjene (1-4). Statistično-mehanična teorija zahteva sicer nekaj več matematičnega znanja, prav tako kode ni moč kupiti in jo je treba praktično za vsak primer napisati posebej. Zato pa teorija ne potrebuje zmogljivega računalnika; večino računov smo naredili na prenosniku. Raziskovali smo agregacijo proteinov, fazne pretvorbe, ki vodijo do razpada v dve tekoči fazi, viskoznost raztopine, lastnosti vode ob površini proteina, ipd.  Prvi računi kažejo, da so raztopine bi-specifičnih protiteles najmanj viskozne, nasprotno pa se moramo strukturam, kjer se Fab in Fc segmenti zaradi komplementarnosti naboja privlačijo, izogniti že pri sami sintezi. Takšna protitelesa  tvorijo v raztopini  močno razvejane  agregate, ki so za pacienta škodljivi (3).

Voda je za biologijo ključnega pomena, saj sodeluje pri zvijanju proteinov, agregaciji, porazdelitvi med fazami, ter pri molekulskem prepoznavanju. Če njeno naravo upoštevamo le približno, nas tudi realističen opis drugih komponent v raztopini, ne pripelje do dobrega rezultata. Na primer, če vodo obravnavamo  kot dielektrični kontinuum (teorija DLVO)  pojavov, ki so odvisni od vrste elektrolita, ne moremo pojasniti.  Prav slednji pa so bistveni za razumevanje dogajanja v bioloških sistemih, ki vsebujejo elektrolite, polielektrolite ter proteine v vodnem mediju.  Iz teh razlogov potrebujemo boljše napovedi hidratacije pri agregaciji proteinov, njihovem obarjanju, kristalizaciji ali tvorbi fibrilov.  V ta namen smo razvili teorijo (5,6), ki omogoča da vodo obravnavamo na enakem nivoju približka, kot druge molekulske vrste prisotne v sistemu. Na ta način bomo bolj pravilno zajeli fiziko hidratacije proteinov in dodanega elektrolita ter realistično ovrednotili vpliv narave nabitih skupin v vodnih raztopinah. Med merljivimi količinami, ki jih bomo izračunali, je najbolj pomemben drugi virialni koeficient, B2 iz katerega se da sklepati na viskoznost in stabilnost raztopine.

Faze projekta

Za prvo leto  planiramo nadaljevanje študija NMR relaksacije v  Laboratory of Physical Chemistry of Electrolytes and Interfacial Nanosystems (PHENIX), Sorbonne University, Pariz. Prvi članek s tega področja je že objavljen, trenutno pripravljamo  drugi del rokopisa.
Nadaljevali bomo tudi s teoretičnimi raziskavami.  Napisali bomo računalniški program za asociativno MSA teorijo za protitelesa v explicitno upoštevani vodi.  Molekule mAbs bodo opremljene z naboji tako, da bodo ioni v raztopini in molekule vode enakovredno “tekmovali” za nabita mesta. Testirali bomo programsko kodo in opravili prve izračune.  Podrobno bomo analizirali rezultate za drugi virialni koeficient ter jih primerjali z rezultati poskusov, objavljenih v literaturi.
Napisali bomo računalniški program za študij t.i. “dual variable domain proteins” v vodi in račune primerjali s poskusi iz literature. Da bi ocenili veljavnost Wertheimovih teorij bomo nadaljevali z računalniškimi simulacijami modelov proteina.  Hkrati  načrtujemo nadaljevanje kalorimetričnih meritev za raztopine proteinov.  Ta metoda je občutljiva na spremembe hidratacije, povzročene s spremembami pH, dodatkom elektrolita ipd.  Predlagali bomo teorijo za proteine v pogojih pomanjkanja prostora kot veljajo v celici.
Ta problem je pomemben za razumevanje tvorbe organel, prisotnih v celici.  Seveda pa se bo program dela prilagajal pomembnosti dobljenih rezultatov. V začetku tretjega leta bomo priredili  “workshop”, da bi tako še bolj opozorili na naše raziskave. Povabili bomo kolege iz industrije pa tudi pomembne raziskovalce iz tujine, da bi skupaj naredili načrte za bodoče delo.

Rezultati

Rezultati bodo objavljeni v uglednih znanstvenih revijah. O njih bomo poročali na konferencah in seminarjih, pa tudi pri sodelujočih skupinah v Parizu (PHENIX, Sorbonne Universities, Francija), Lvivu (ICMP, Ukrajina) in na Stony Brooke (Laufer Center, ZDA) pa tudi sodelavcem v  industriji.  V letu 2019 smo imeli naslednja predavanja:

• VLACHY, Vojko. Protein solvation and self-assembly in aqueous electrolyte solutions: [plenary lecture]. V: Systems with competing electrostatic and short-range interactions: III CONIN Workshop, Lviv, Ukraine, 2019.
• JANC, Tadeja, LUKŠIČ, Miha, VLACHY, Vojko, ROLLET, Anne-Laure, KORB, Jean-Pierre, MÉRIGUET, Guillaume, MALIKOVA, Natalie. Salt specific effects on NMRD profiles of protein solutions:[oral communication]. 11th Conference on FFC NMR Relaxometry, Pisa, Italy, 2019.
• V. Vlachy je imel predavanje na Laboratory of Physical Chemistry of Electrolytes and Interfacial Nanosystems (PHENIX), UMR CNRS-UPMC 8234, Sorbonne University, v Parizu Francija. Predavanje je bilo 27. 11. 2019 in imelo naslov: Liquid-liquid phase separation in aqueous protein solutions.
• Profesor Y.V. Kalyuznyi je o našem skupnem delu poročal na Joint EMLG /JMLG conference 2019 Kutná Hora Czech Republic, 8 -13 september,  2019. Bil je vabljeni predavatelj, naslov predavanja: "Explicit water theory for the salt-specific effects and Hofmeister series in protein solutions".

Članki:

• Aggregation, liquid–liquid phase separation, and percolation behaviour of the model antibody fluid constrained by hard-sphere obstacles.- T. Hvozd, Yu. V. Kalyuzhnyi, V. Vlachy. Soft Matter 16, 8432-8444 (2020). (DOI: 10.1039/D0SM01014F)
• Multi-scale water dynamics on protein surfaces: protein-specific response to surface ions, T. Janc, J-P. Korb, M. Lukšič, V. Vlachy, R. G. Bryant, G. Meriguet, N. Malikova*, and A-L. Rollet*. J. Phys. Chem. B, 2021, 125, 8673−8681 (2020). (DOI: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpcb.1c02513)
• Phase-stability of aqueous mixtures of bovine serum albumin with low molecular mass salts in presence of polyethylene glycol.- H. Džudžević Čančar, M. Belak Vivod, V. Vlachy, and M. Lukšič*. J. Mol. Liquids, 349 (2022) 118477. (DOI: https://doi.org/10.1016/j.molliq.2022.118477)
• Empty liquid state and re-entrant phase behavior of the patchy colloids confined in porous media.- T. Hvozd, Y. V. Kalyuzhnyi*, V. Vlachy, and P. T. Cummings. J. Chem. Phys. 156, 161102 (2022). (DOI: https://doi.org/10.1016/j.molliq.2022.118477)