FKKT

Šifra projekta: J1-50026

Vodja projekta: doc. dr. San Hadži

Sodelujoči:

Mojca Hunski, Jernej Imperl, dr. Jurij Lah, dr. Helena Motaln (IJS), dr. Boris Rogelj (IJS), Maja Šimaga (IJS), Uroš Zavrtanik.

Odkritje, da se nekatere celične strukture vedejo kot kapljice in delujejo kot brez-membranski organeli, je bilo prelomno odkritje v sodobni biologiji. Dejstvo, da se tvorijo spontano z ločevanjem tekočine na bolj gosto in na redkejšo fazo (fazni prehod tekoče-tekoče), kar je sicer znan fizikalno-kemijski pojav, je sprožilo veliko zanimanje in potrebo po razjasnitvi biofizikalnih in molekularnih osnov tega procesa. To ni pomembno le z vidika bolj poglobljenega razumevanja odnosa med zaporedjem in strukturo v proteinih, ampak tudi zato, ker so okvare pri fiziološki fazni separaciji vzrok več človeških bolezni (ALS, demenca, genske ekspanzije itd.). Zato je potrebno razumeti proces fazne separacije na molekularni ravni, kar lahko vodi do odkritja načinov da ta proces uravnavamo s pomočjo zunanjih dejavnikov, na primer z majhnimi molekulami.

Biomolekularni kondenzati so običajno obogateni s proteini, ki vsebujejo dolge neurejene regije. Te regije pogosto vsebujejo sekvence z nizko kompleksnostjo, kar pomeni da se v sekvenci pojavlja le nekaj tipov aminokislin, te se ponavljajo in ne tvorijo stabilne sekundarne strukture. Regije z nizko kompleksnostjo so te, ki spodbujajo fazno separacijo v proteinih samih ali pa v kombinaciji z drugimi biomolekulami, zlasti RNA. Doslej je bilo identificiranih več nizko kompleksnih zaporedij, ki spodbujajo fazno separacijo. Ti motivi imajo lahko različne kemijske 'značaje' - lahko so polarni, pozitivno nabiti ali hidrofobni. Pogosto so okrašeni z aromatičnimi ostanki (Y/F), za katere je bilo ugotovljeno, da so ključni za faznos separacijo, saj posredujejo kratkosežne interakcije. Tovrstni nizkokompleksni motivi lahko vzpostavijo šibkih, kratkotrajne, multivalentne interakcije prek lepljivih ostankov (aromatičnih, nabitih), medtem ko polarni ostanki ohranjajo tekočini-podoben značaj kondenzata.

V zadnjih letih so se začeli pojavljati dokazi, ki kažejo na drug, spregledan nizko kompleksni motiv obogaten z alaninom. Nedavno so bili tovrstni alaninski motivi identificirani v dveh proteinih, ki vežejo RNK (TDP-43 in Musasi-1), in dokazano je, da posredujejo pri fazni separaciji najverjetneje preko drugačnega mehanizma pri katerem igrajo pomembno vlogo alfa-vijačnice. Naši predhodni podatki kažejo, da so z alaninom bogati motivi, zelo pogosti v RNA-vezavnih proteinih in najverjetneje predstavljajo nov funkcionalni motiv za fazno separacijo. Poleg tega so alaninske ekspanzije zelo redka in manj raziskana skupina genetskih bolezni. Šele nedavno je bilo ugotovljeno, da lahko tovrstne alaninske ekspanzije v nekaterih proteinih vplivajo na fazni prehod in na ta način povzročijo bolezneska stanja. Tako se zastavlja vprašanje ali z alaninom bogate sekvence resnično predstavljajo nov razred funkcionalnih motivov, ki spodbujajo fazno separacijo. Glede na to, da je alanin struktura, ki spodbuja tvorbo stabilnih struktur, kaže da se bo mehanizem fazne separacije razlikoval od trenutno predlaganih modelov, ki bazirajo na neurejenosti regij in na pomemben vplivu aromatskih ostankov.

Slika 1: Biomolekularne kondenzate tvorijo neurejeni proteini z nizko sekvenčno kompleksnostjo. Ko koncentracija proteina preseže kritično mejo se topljenec loči na bolj redko in bolj gosto tekočo fazo. Gosta faza se organizira v kapljice suspendirane v redkejši fazi. Tipično fiziološko pomembne biomolekularne kondenzate sestavljajo proteini z nizko sekvenčno kompleksnostjo (veliko število ponovitev nekaj vrst aminokislin) in RNA. Gostejšo fazo stabilizirajo interakcije topljenec-topljenec med 'lepljivimi' (ang. sticker) amino kislinami, običajno so to aromatske in nabite. Slednje so ločene z daljšimi regijami polarnih in fleksibilnih aminokislin (distančniki ang. spacer), ki skrbijo da so kondenzati hidrirani in dinamični in preprečujejo pretvorbo v trden agregate

Cilj tega predloga je raziskati, ali z alaninom bogate regije v RNA-vezavnih proteinih predstavljajo funkcionalne motive, ki spodbujajo fazno separacijo, in razumeti biofiziko, ki stoji za tem. Predlagamo uporabo interdisciplinarnega pristopa, kjer bomo kombinirali bioinformatiko, biokemične in biofizikalne metode ter celično biologijo, da bi: i) ugotovili ali z alaninom bogate regije predstavljajo nov funkcijonalni motif, ki omogoča fazno separacijoS, ii) razumeli biofiziko fazne separacije prek alaninskih motivov in iii) razvili orodje za napovedovanje za odkrivanje motivov, bogatih z alaninom, ki spodbujajo fazno separacijo. Rezultati tega projekta bodo tako omogočili identifikacijo novih proteinov, ki fazno separiriajo, kar bo vodilo k novim biološkim dognanjem in omogočilo načrtovanje novih vrst modifikatorjev fazne separacije v proteinih.

Slika 2: Različni tipi regij z nizko kompleksnostjo omogočajo fazno separacijo v RNA-vezavnih proteinih. V tem projektu bomo skušali ugotoviti ali so regije bogate z alaninom nov tip sekvenčnega motiva, ki omogoča fazno separacijo .

Projekt je razdeljen na več faz, namen in učinki projekta pa so naslednji:

1. Identificirali bomo nabor proteine, ki fazno separirajo preko novega, z alaninom bogatega sekvenčnega  motiva. Razvili bomo računalniško orodje, ki bo olajšalo identifikacijo takšnih motivov iz proteinskih sekvenc. 

2. Drugačen biofizikalni mehanizem fazne separacije bo razširil repertoar potencialnih modulatorjev majhnih molekul. Predvidevamo, da se mehanizem fazne separacije razlikuje od do sedaj opisanih mehanizmov (sticker-spacer model). Predvidevamo, da bo struktura v kondenzatih alaninskih motivov drugačna od trenutno karakteriziranih in bo vsebovala delno alfa-vijačnice. Poleg tega bo gonilna sila verjetno bolj hidrofobna; morda tudi izkazujejo nižjo kritično temperaturo raztopine (običajno nizkokompleksni motivi kažejo le zgornjo kritično temperaturo raztopine

3. Nakazali bomo na možne povezave med genskimi obolenji alaninskih ekspanzij in LLPS. Rezultati bodo tudi pospešili razumevanje funkcionalnosti alaninskih sekvenc v širšem kontekstu. Z alaninom bogate sekvence so tudi sestavine biomaterialov, kot sta svila in elastin, in so vključene v redke genetske motnje pri ljudeh, znane kot ekspanzije alanina. Do podatkov je bilo identificiranih 9 človeških bolezni, ki jih povzročajo ekspanzije alanina, in predstavljajo drugo najpogostejšo vrsto genske ekspanzije za polyQ. Kljub temu so ekspanzije alanina še vedno slabo raziskane in ne poznamo molekularne osnove teh bolezni. Predvidevamo da bodo naši rezultati premostili vrzel med področjem LLPS in ekspanzijami gena alanina.