Stabilnost nove vrste kvadruplesov DNA (AGCGA) in njihovo prepoznavanje z nanotelesi

true

Šifra projekta:     J1-1706 (C)
Vodja projekta: prof. dr. Jurij Lah
Financiranje: Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS)
Obdobje financiranja: 1. 7. 2019 – 30. 6. 2022

Člani projektne skupine (vsi FKKT)

Leta 1953 sta Watson in Crick predstavila strukturo dvoverižne DNA, ki se je močno vtisnila v spomin človeštva. Danes je znano, da lahko DNA tvori tudi druge fiziološko pomembne (nekanonične) strukture kot so G-kvadrupleksi (G4), ki nastanejo v zaporedjih baz bogatih z gvanini, in i-motivi, ki se oblikujejo iz komplementarne s citozini bogate verige. Vloga G4 in i-motivov pri regulaciji izražanja genov povezani z boleznimi, kot so rak, Alzheimerjeva bolezen in sladkorna bolezen je predmet obsežnih raziskav. Strukture G4 in i-motivov se večinoma proučuje in vitro, njihov obstoj v celicah je bil dokazan s pomočjo vezanja specifičnih protiteles.

V zadnjem času je bila odkrita nova nekanonična struktura, imenovana AGCGA-kvadrupleks, ki se tvori v baznih zaporedijh s ponovitvami AGCGA. Na biološko pomembnost te strukture kaže bioinformacijska študija, ki je identificirala zaporedja s ponavljajočimi se motivi AGCGA v več kot 40 človeških genih, povezanih z regulacijo osnovnih celičnih procesov, nevroloških motenj, raka in nenormalnosti pri razvoju kosti in hrustanca, mutacije teh zaporedij pa so povezane z avtizmom.

Vprašanje je, ali se AGCGA-kvadrupleksi tvorijo in vivo. Odgovor zahteva razvoj specifičnih ligandov, ki bodo prepoznali AGCGA-kvadrupleks v celičnem oz. nativnem kontekstu. V tej luči načrtujemo razvoj nanoteles (enoverižnih kamelidnih protiteles), ki bi specifično prepoznala AGCGA-kvadrupleks in eventuelno G4 in i-motiv. Preučevali bomo afiniteto, specifičnost, selektivnost in strukturne značilnosti vezanja nanoteles na DNA. Nanotelesa z najboljšimi vezavnimi lastnostmi bodo uporabljena za odkrivanje nekanoničnih struktur DNA v celicah z imunofluorescenčnimi tehnikami. Hkrati bomo raziskali, kako različni pogoji (koncentracija kationov, aktivnost vode, nagneteno okolje: »crowding«) vplivajo na stabilnost AGCGA-kvadrupleksa in drugih preiskovanih nekanoničnih struktur in vitro. Rezultati bodo služili kot podpora študiji izvedeni in vivo.

Pričakujemo, da bo ugotavljanje obstoja nove vrste nekanonične strukture DNA strukture in vivo spodbudilo raziskave na področju biologije nekanonične DNA, pri čemer bodo specifična protitelesa (nanotelesa) predstavljala pomembno raziskovalno orodje.

Slika 1: Strukturne značilnosti AGCGA-kvadrupleksa (Kocman V., Plavec J. Nat. Commun. 2014, 5, 5831. Kocman V., Plavec J. Nat. Commun. 2017, 8, 15355) se razlikujejo od tistih za B-DNA, G-kvadrupleks in i-motiv. Obstoj strukture in vivo in njen fiziološki pomen nista poznana.

M1. Pridobivanje nanoteles, ki ciljajo kvadruplekse
M2. Identifikacija najboljših kandidatov (nanoteles) za nadaljnje raziskave
M3. Strukturna karakterizacija epitopa kvadrupleksov
M4. Termodinamska analiza stabilnosti kvadrupleksov v kontekstu dvoverižne DNA
M5. Vizualizacija kvadrupleksnih struktur v celicah

Člani projektne skupine so rezultate raziskav obnašanja DNA v zadnjih letih objavljali v uglednih revijah s področja kemije, biokemije, molekularne biologije in biofizike. Pričakujemo, da bodo rezultati raziskav, pridobljeni ob podpori dolgoletnih sodelavcev (prof. J. Plavec, prof. R. Loris), objavljeni v znanstvenih revijah, ki so visoko cenjene med kolegi raziskovalci. O odmevnejših rezultatih nameravamo poročati tudi splošni javnosti.